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过氧化物酶标记测定细胞凋亡


过氧化物酶标记测定细胞凋亡

本实验用过氧化物酶标记测定了细胞凋亡。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。
实验原理
脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯壹来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体**的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。
主要试剂
1. 磷酸缓冲液PBS(pH7.4):磷酸钠盐50mM,NaCl200mM。
2. 蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶K0.02g;PBS100ml。
3. 含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4):H2O22.0ml;PBS缓冲液98.0ml。
4. TdT酶缓冲液(新鲜配):Trlzma碱3.63g用0.1NHCl调节pH至7.2,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸钠29.96g和氯化钴0.238g。
5. TdT酶反应液:TdT酶32μl;TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用。
6. 洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠17.4g;柠檬酸钠8.82g;ddH2O1000ml。
7. 0.05%二氨基联苯(DAB)溶液:DAB5mg;PBS10ml,pH7.4,临用前过滤后,加过氧化氢至0.02%。
8. 0.5%甲基绿(pH4.0):甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml。
9. 100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。
10. 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)。
实验步骤
1. 标本预处理:
   1)石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min。用无水乙醇洗两次,每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug/ml),于室温水解15min,去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作。
   2)冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作。
   3)培养的或从组织分离的细胞的预处理:将约5×107个/ml细胞于4%中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50~100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作。
2. 色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min。用PBS洗两次,每次5min。
3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,马上在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1~5min。
4. 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,马上在切片上滴加54μlTdT酶反应液,置湿盒中于37℃反应1hr(注意:阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液)。
5. 将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动。
6. 组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min。
7. 用PBS洗4次,每次5min。
8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液,室温显色3~6min。
9. 用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,*后1次5min。
10. 于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,*后1次静置30s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。
11. 用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果。
注意事项
一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松(1μM)处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血**细胞。阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同。

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